本文摘要：在2013年，来自麻省总医院的研究人员找到用于CRISPR－CasRNA引导性核酸酶的一个最重要局限：不会在预期靶点以外的位点上分解多余的DNA变异。

在2013年，来自麻省总医院的研究人员找到用于CRISPR－CasRNA引导性核酸酶的一个最重要局限：不会在预期靶点以外的位点上分解多余的DNA变异。此后相继有研究必要说明了CRISPR／Cas9不存在相当严重的脱靶性，即该技术可以再次发生非特异性切割成，引发基因组非靶向位点的变异，这样不会导致研究结果的不确定性以及研究工作的大量减少，这一问题相当严重地容许了Cas9的应用于。

因此科学家们期望能通过仅有基因组检测脱靶剪切，近年来研发了不少检测脱靶剪切酶活性的实验方法，比如近期NatureMethods报导的两项技术，这些技术是什么，具备何种优势，明确让我们来想到：GUIDE－seq以往人们在检测CRISPR－Cas核酸酶诱导的脱靶DNA脱落时，往往事前假设脱靶位点与靶标位点相近。GUIDE－seq是首个不必须这样做到的方法，而且它非常灵敏。一组研究人员利用一种较短双链寡核苷酸来标记CRISPR－Cas诱导的脱靶脱落，测序这些标签所在的基因组区域，就需要确认脱靶变异的方位。

研究指出，就算某个脱靶变异的经常出现频率较低至0．1％，GUIDE－seq也需要检测获得。由于许多脱靶变异再次发生在与目标位点差异相当大的地方，因此脱靶DSB的数量和方位是很难预测的。

现有工具主要是通过分析目标序列来预测脱靶变异，研究人员将这些工具与GUIDE－seq展开了较为。研究表明，上述工具在预测已检验的脱靶位点时比GUIDE－seq差很多，还不会错误检测实质上不被酶托的位点。

此外，研究人员还对比了GUIDE－seq和ChIP－seq（检测蛋白与DNA的融合），结果证明ChIP－seq并不是检验CRISPR－Cas脱靶DSB的可信方法。Digenome－seq来自韩国釜山大学、釜山基础科学研究所等机构的研究人员在Nature旗下子刊《NatureMethods》公开发表一项研究，顺利证实CRISPR－Cas9在人类细胞中有准确的射击训练起到，他们研发出有一种强劲、脆弱、无偏见和具备成本效益的方法——Digenome－seq，可在全基因组范围内检测人类细胞中的CRISPR／Cas9脱靶效应。

在这项研究中，研究人员称之为，虽然RNA引领的、通过CRISPR－Cas9系统的基因组编辑早已被普遍应用于生物医学研究，但是Cas9核酸酶的全基因组靶向特异性依然是有争议的。为此，他们明确提出一种方法Digenome－seq，利用基因组测序查询CRISPR－Cas9有可能变异产生的射击训练和脱靶序列。他们用Cas9核酸酶在试管中消化人类基因组DNA，然后展开仅有基因组测序。这种体外消化可产生射击训练和脱靶序列的独有模式，可以通过计算出来确认。

此外，个在sgRNA末端加到构成CRISPR－Cas9的鸟嘌呤核苷酸，研究人员顺利地制取了这种高度发达的可编程核酸酶，在人类基因组中它没可测量的脱靶效应。此后，这一研究组又发布了Digenome－seqUltra，并且他们用这一技术同时分析了11个CRISPR－Cas9核酸酶在整个基因组中的特异性，大大节省了CRISPR脱靶分析所需的时间和经费。

研究人员再行将基因组DNA从人类细胞中萃取出来，然后用多个sgRNA－Cas9人组展开消化，最后展开仅有基因组测序。他们用一种新的DNA剪切评分系统，检验了Cas9在基因组中的剪切模式，即射击训练和脱靶位点的特性。研究指出，mRNA自双链寡核苷酸的sgRNA引发了许多脱靶事件，而mRNA自质粒模板的sgRNA没这样的问题。多重化Digenome－seq可以捕捉到很多被其他方法漏掉的良性脱靶位点。

研究人员还在此基础上得出了增加CRISPR－Cas9脱靶效应的指南。

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